dna甲基化检测原理-微谱第三方检测机构

dna甲基化检测原理来找微谱！微谱解决dna甲基化检测原理问题是很专业的哦！DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，可以在不改变DNA序列的情况下改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，甲基共价键合在基因组CpG核苷酸的胞嘧啶5号碳位点上。DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。以下是微谱小编带来的dna甲基化检测原理！

dna甲基化检测原理：

HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年[1]***次报道，邓大君等[2]对该方法进行改进，与PCR连用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的gDNA进行PCR扩增，由于原甲基化位点在重亚硫酸盐的处理下仍被保留为胞嘧啶，因此与未发生甲基化片段相比，甲基化片段PCR产物的变性温度相应升高，是PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，以此测定PCR产物中的甲基化情况。

该方法***明显的优点是可用于高通量混合样本的检测，能够显示目标片段整体甲基化程度，但不能对甲基化的CpG位点进行定位。

直接测序是有Frommer等[3]提出的研究DNA甲基化的方法，该方法也是先利用重亚硫酸盐处理DNA，是其上为发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，然后采用PCR方法扩增目标片段，***后对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列进行比较，判断是否有CpG位点发生甲基化。

这种方法是利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区域不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常用的酶有HpaII-MspI（识别序列CCGG）和SmaI-XmaI（识别序列CCCGGG）等。以HpaII-MspI为例，二者均能识别CCGG序列，但当序列中的胞嘧啶发生甲基化时，HpaII不切割，利用HpaII-MspI的这种属性处理DNA，随后进行Southern或PCR扩增分离产物，以明确目标片段的甲基化状态[4,5]。

1996年Herman等[6]在使用重亚硫酸盐处理的基础上建立的一种方法，该方法也是利用了处理前后未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶的原理，对处理后的gDNA进行引物特异性的PCR。MSP实验过程中需设计两对引物，并要求引物末端均设计***检测位点结束，且两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对（即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链）。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若用甲基化DNA链的引物能扩增出目标片段，则说明该被检测位点存在甲基化，反之则该位点不存在甲基化。

由于高密度芯片在一张芯片上可设计数十万个探针，因此，基于芯片平台的全基因组甲基化分析无疑是性价比***高的全基因组甲基化图谱分析方式。目前市场上使用较多的是Illumina公司的甲基化芯片，该芯片前期处理采用的是亚硫酸盐，将甲基化的差异转变成碱基上的差异，然后利用两个位点特异的探针检测这些化学上差异的位点，一个探针是为甲基化位点（M磁珠类型）设计的，而另一个是为未甲基化位点（U磁珠类型）设计的，结合后通过单碱基延伸掺入一个荧光标记的ddNTP，并通过检测和计算甲基化位点和未甲基化位点掺入的荧光信号强度***终确定DNA甲基化程度。

Illumina甲基化芯片可一次性检测>850,000个CpG位点，并在单点水平上进行定量检测，且实验无需PCR反应，不依赖限制性内切酶，保证了高质量的实验数据。

MassARRAY®DNA甲基化检测

Massarray主要是利用飞行时间质谱技术对目标片段的甲基化程度加以检测。该方法前期也需进行亚硫酸盐处理，将DNA中的未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U）,由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化。利用5'末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增，产物经SAP（虾碱性磷酸酶）处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件EpiTYPER则能根据分子量自动分析出相应片段的甲基化程度。

该方法可做到定性定量分析一步到位，在每次实验中能够对不超过700bp的目标区域上的CpG位点进行准确定量，更适用于对候选区域进行甲基化定量检测，同时也是甲基化芯片后期验证的不二之选。